不對稱催化是現代合成化學中制備手性分子的核心技術。在傳統熱催化中，手性催化劑通過降低反應活化能壘，選擇性活化與之結合的底物，從而實現手性誘導。然而，在光催化反應，特別是通過能量轉移（EnT）途徑進行的反應中，一個根本性挑戰在于：在非選擇性的光照條件下，游離于催化劑之外的底物同樣會被激發，進而發生非手性的背景反應，導致產物對映選擇性下降。

盡管通過開發親和性手性光敏劑或底物發色團活化等策略，已在特定體系中實現了激發態的對映選擇性控制，但這些方法通常要求底物的吸收波長與光敏劑有顯著差異。對于吸收光譜與光敏劑重疊或更長的底物，其直接激發導致的背景反應難以避免。

鐘芳銳和吳鈺周團隊在前期的研究中，基于基因密碼子擴展技術構建了“三重態人工光酶”（Nature, 2022, 611, 715，Nature：首例光酶催化對映選擇性[2+2]-環加成反應），利用能量轉移活化的空間鄰近依賴性和酶空腔的限域效應，實現了能量轉移催化吲哚底物的對映選擇性[2+2]環加成。這類光酶可利用其固有的手性空腔，通過多重非共價相互作用精確排列底物與光敏劑，實現高效的能量轉移與優異的立體控制，例如用于對映選擇性[2+2]光環加成反應。然而，BpA輔因子的固有吸收范圍（365–390 nm）限制了其應用，且對于在此窗口內有吸收的底物，背景反應問題依然突出。

為解決上述挑戰，本研究從自然界的區室化概念中獲得靈感，提出了一個集成解決方案：利用蛋白質空腔對反應體系進行物理空間上的分割，創造一個獨特的、與外部本體溶液分離的封閉酶腔。

·酶腔內部（催化區室）： 在蛋白質空腔內，遺傳編碼的BpA光敏劑與底物在限域的手性環境中近距離接近，促進高效且受保護的能量轉移過程，實現對映選擇性催化。

·本體溶液（淬滅區室）： 在蛋白質結構域外的溶液中，通過引入精心設計的三重態淬滅劑，利用碰撞淬滅機制抑制游離底物因直接激發而產生的背景反應。

該設計的核心在于，通過蛋白質的物理屏障和理性設計的淬滅劑，實現“腔內外”反應路徑的精準調控，在促進腔內手性反應的同時，抑制腔外的外消旋路徑。

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1. 概念驗證與光酶庫初篩

研究選取了1-萘酚衍生物1a作為模型底物，因其在300-390 nm的紫外吸收與BpA嚴重重疊。實驗證實，在365 nm光照下，1a存在顯著的非催化背景反應（37%產率），且該反應可被氧氣（一種已知的三重態淬滅劑）有效抑制，表明背景反應經由底物的三重態進行。

為尋找合適的光酶平臺，研究團隊構建了一個包含LmrR、CgmR、RamR、QacR、TM1030和tHisF六種不同蛋白質骨架、共24個BpA嵌入突變體的光酶庫。在高通量篩選后，發現基于RamR蛋白的變體，特別是RamR_F155BpA（命名為RamR1.0），在催化1a的[2+2]光環加成中展現出最優的活性和對映選擇性（厭氧條件下37%產率，30% e.e.）。

圖2. 光酶酶庫的構建與篩選

2. 三重態淬滅劑的理性設計與優化

在確認RamR1.0的催化能力后，研究系統評估了不同淬滅劑對反應的影響。

·氧氣： 在空氣和氧氣氛圍下，反應的e.e.值分別提升至34%和46%，印證了區室化淬滅的概念。然而，氧氣同時引發了底物和產物的氧化副反應，導致質量平衡下降。

·常規小分子淬滅劑： 測試了(E)-1,2-二苯乙烯（TQ1）、2,5-二甲基己-2,4-二烯（TQ2）和苝（TQ3）。盡管TQ1和TQ2能提升e.e.值，但它們嚴重抑制了轉化率，推測是由于這些疏水性小分子可自由進入酶腔，干擾了內部的EnT過程。

·定制化淬滅劑： 為克服上述限制，團隊設計了(E)-4-苯乙烯基苯甲酸（TQ4）。在反應pH條件下，TQ4的羧基處于去質子化狀態，帶負電。由于RamR活性中心入口周圍富集了多個帶負電荷的酸性氨基酸殘基（如Glu129, Asp132等），靜電排斥作用阻止了TQ4進入酶腔，使其能夠選擇性地淬滅溶液中的激發態底物。實驗結果證實，TQ4在顯著提升對映選擇性的同時，保持了良好的反應性和質量平衡。

·大分子淬滅劑： 進一步合成了二苯乙烯功能化的牛血清白蛋白（BSA-TQ1），利用其巨大的分子尺寸實現空間排斥，同樣取得了成功。

瞬態吸收光譜分析為區室化保護提供了直接證據：RamR1.0-BpA的激發態壽命在氧氣存在下幾乎不變，而游離BpA的壽命則被氧氣顯著淬滅，表明蛋白質空腔有效保護了內部光敏劑免受外部淬滅劑的影響。

圖3. 三重態淬滅劑的概念驗證

3. 蛋白質工程與催化性能提升

以RamR1.0為起點，研究團隊通過聚焦半理性定點飽和突變對其進行了定向進化?；赗amR的晶體結構和分子對接模擬，對底物結合口袋周圍的12個殘基進行突變，最終獲得了最優變體RamR3.0（F155BpA/K63R/S67W/S134A）。

RamR3.0與底物1a的復合物晶體結構（分辨率2.50 ?）揭示了其高選擇性機制：BpA光敏劑與底物萘環之間的距離為5.7 ?，確保了高效的三重態能量轉移。突變殘基R63與底物的芐基形成π-陽離子相互作用。突變殘基A134與底物的萘基形成π-烷基相互作用。此外，底物還與T55、A110、V138、D152、L156、M184等多個殘基存在廣泛的非共價相互作用網絡，包括C-H…π、π-硫、π-σ和π-烷基作用。底物的芐基與BpA之間存在π-π堆積作用。這些相互作用共同將底物穩定在特定構象，使其烯烴側鏈優先接近萘環的一個對映異位面，從而實現了高度的立體控制。在TQ4存在下，RamR3.0催化模型反應的產率達70%，對映選擇性高達94% e.e.。

圖4 人工光酶的定向進化和晶體解析

4. 底物普適性與策略通用性

研究考察了RamR3.0-TQ4體系對多種1-萘酚及2-萘酚衍生物的適用性。結果表明，帶有不同電性取代基的底物、酚酯、芐酯同系物、含氮雜環底物以及更具挑戰性的萘基酮類底物，在該體系下大多能以良好至優秀的產率和對映選擇性（多數 >90% e.e.）得到相應的環加成產物。淬滅劑TQ4在所有案例中均一致地提升了產物的立體化學純度。

圖5. 底物普適性

該區室化策略被證明具有廣泛的通用性：成功應用于基于噻噸酮輔因子的人工光酶（CMP4.0）催化的環加成反應。在間歇反應和連續流光反應器中均能穩定運行。在克級規模的流動化學合成中，產物2m以98%的分離產率和91% e.e.獲得，展示了其應用于規?；铣傻臐摿?。實現了全細胞光生物催化。在表達RamR光酶的大腸桿菌細胞內，盡管胞內環境復雜，仍能成功實現1m的光環加成，獲得73%產率和82% e.e.。添加TQ4后，對映選擇性進一步提升，且細胞在光照后仍保持高活性（存活率>97%），證明了該策略在生命體系中的適用性。

圖6. “空間分區“光酶催化策略的通用性和兼容性

本研究成功開發了一種生物催化“區室化”策略，通過整合人工三重態光酶與定制的三重態淬滅劑，有效解決了不對稱能量轉移催化中的外消旋背景反應這一關鍵科學問題。該工作不僅拓展了人工光酶的工具箱，更重要的是展示了一種通過物理空間分區來精準控制光化學反應路徑的創新范式。隨著合成生物學與蛋白質工程技術的不斷發展，這種將生物區室化優勢與合成化學理性設計相結合的策略，有望在復雜手性分子的綠色合成、生物相容性光化學以及細胞內的精準合成生物學等領域發揮重要作用。

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